CaCo-2細胞模型法評價SNAC對Semaglutide腸吸收影響的實驗

方案草案

1、CaCo-2 細胞模型簡介

CaCo-2細胞系人結(jié)腸腺癌細胞(the human colonadenocarcinoma cell line)是一種結(jié)構(gòu)和功能類似于分化的小腸上皮細胞，具有微絨毛等結(jié)構(gòu)，并含有與小腸刷狀緣上皮相同的酶系統(tǒng)，也具有小腸上皮類似的胞飲功能，可以用來進行模擬體內(nèi)腸轉(zhuǎn)運的實驗。在細胞培養(yǎng)條件下，CaCo-2細胞生長在多孔的可滲透聚碳酸酯膜上的細胞可融合并分化為類腸上皮細胞，形成連續(xù)的單層。

2、CaCo-2 細胞模型的運用

現(xiàn)代藥物研發(fā)成功與否，與藥物的代謝特性密切相關(guān)。人工合成和篩選的化合物已被大規(guī)模的高通量篩選所取代，無論是開發(fā)新藥還是開發(fā)新的給藥途徑，化合物在體內(nèi)的吸收特性都具有突出的地位。以往傳統(tǒng)的體內(nèi)藥代吸收篩選模型，由于所需藥物量大、難以批量化、耗時長以及費用高等弊端，已經(jīng)無法滿足現(xiàn)代新藥的研發(fā)要求，因而開發(fā)新的快速、準確以及需藥量少的藥物吸收篩選模型已成為新藥研發(fā)的必然趨勢。被廣泛采用的三種篩選方法是：大鼠原位單次灌注法、大鼠外翻腸囊法以及CaCo-2細胞模型法。其中，CaCo-2細胞模型法已經(jīng)成為一種預(yù)測藥物人體小腸吸收以及研究藥物轉(zhuǎn)運機制的標準體外篩選工具。

人類小腸上皮中的各種轉(zhuǎn)運系統(tǒng)、代謝酶等在CaCo-2細胞中也有相同的表達，如細胞色素P450同工酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)肽酶、堿性磷酸酶、蔗糖酶、葡萄糖醛酸酶。同時糖、氨基酸、二肽、維生素等多種主動轉(zhuǎn)運系統(tǒng)在CaCo-2細胞中都有與小腸上皮細胞類似的表達，非常接近藥物在人體內(nèi)吸收的實際環(huán)境。

小腸上皮的代謝、受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運、p-gP對藥物分子的泵出，均為酶學(xué)飽和的動力學(xué)。聯(lián)合用藥時，因為存在藥物相互競爭的酶、載體或p-gP的作用，所以與單獨給藥時的生物利用度存在差異，這一相互作用可以通過CaCo-2細胞模型進行研究。尤其近年來發(fā)現(xiàn)p-gP成為藥物吸收的一個重要生化屏障，它把進入細胞內(nèi)的藥物泵出，因此成為口服藥物生物利用度低、波動大的一個重要影響因素。CaCo-2細胞具有p-gP的表達，非常適合用吸收機制的深入研究。

3、Semaglutide的口服吸收研究

已有文獻報道，Semaglutide 5mg，SNAC150mg或300mg能顯著增加Semaglutide在胃內(nèi)的吸收，本研究運用CaCo-2細胞模型法探討SNAC是否能夠促進Semaglutide在小腸吸收。

3.1研究方法：

3.1.1實驗材料

CO₂培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，冷凍高速離心機，超凈工作臺，水浴鍋，酶標儀，培養(yǎng)皿，凍存管，移液槍，培養(yǎng)基，Transwell等。

3.1.2供試品

Semaglutide原料，由杭州先為達生物科技有限公司提供，批號：  

SNAC，由成都普康生物科技有限公司提供，批號：   COA見附件。

鵝去氧膽酸，由成都普康生物科技有限公司提供。

3.1.3實驗方法

3.1.3.1細胞培養(yǎng)階段

細胞來源：中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫（白人，男性，72歲）。常規(guī)方法復(fù)復(fù)蘇細胞，形成細胞懸液。接種到Transwell后，于第7、14、21天做堿性磷酸酶活性檢測，判斷CaCo-2細胞在生長的分化程度；于第7、9、11、13、15、17天檢測CaCo-2 細胞單層跨膜電阻值(Transepithelial Electrical Resistance，TEER) ，當 TEER 值穩(wěn)定在500?1500 Ω·cm2 之間時，表明其單層膜達到致密性，具有轉(zhuǎn)運和吸收功能；在第21天做苯酚紅的通透性實驗，計算表觀滲透系數(shù)，小于1 x 10⁶，即說明單層膜細胞連接緊密完整性良好。以上驗證完成后即表明Caco-2 細胞模型的構(gòu)建完成，可作為模擬小腸體外轉(zhuǎn)運模型。

3.1.3.2 Semaglutide細胞毒性試驗

根據(jù)Semaglutide口服制劑規(guī)格，評價Semaglutide  1~20ug/ml濃度范圍內(nèi)，CaCo-2 細胞存活率，選擇無細胞毒性濃度區(qū)間進行后期實驗。初步估算濃度可選擇2.5ug/ml。

3.1.3.3 SNAC及鵝去氧膽酸細胞毒性試驗

根據(jù)既往研究經(jīng)驗，SNAC在50ug/ml到200ug/ml之間，細胞存活率無影響；在200ug/ml到800ug/ml，細胞存活率顯著下降。初步?jīng)Q定SANC試驗濃度為200ug/ml。

根據(jù)既往研究經(jīng)驗，鵝去氧膽酸試驗濃度為10~15mmol/L

3.1.3.4 SNAC對Semaglutid吸收影響試驗

實驗分組如下：

Transwell上室加藥，下室取樣檢測藥物濃度，每組3復(fù)孔。各組分別于加樣后5min，15min，30min，45min，60min，90min取樣檢測，每次取樣50ul~100ul,并根據(jù)取樣體積補足液體，后期計算分析中計算累積滲透量及滲透率。

取樣后-80℃冰箱保存，干冰郵寄至杭州先為達生物科技有限公司進行檢測，檢測數(shù)據(jù)反饋后計算滲透率。

測試分析方法：略

計算分析：略

4、研究經(jīng)費

康寧公司Transwell一板為12孔，做3復(fù)孔可以同時做4個樣品，本實驗室一次細胞培養(yǎng)可做6板，最多可評價24個樣品，能夠?qū)崿F(xiàn)較大樣品/方案的篩選，為保證質(zhì)量，每次建議做1~4板。結(jié)合多年研究經(jīng)驗，本實驗室按照Transwell板數(shù)量進行收費。